二本鎖dna 変性酵素

制限酵素（せいげんこうそ）は、酵素の一種。 2本鎖のdnaを切断する。必須因子や切断様式により3種類に大別されるが、そのうちのii型酵素が遺伝子組み換えに多用される。

多様な制限酵素の認識するまた制限酵素は遺伝子組み換えの他にも、II型制限酵素による切断の例（大文字が認識される回文配列）

制限酵素は、酵素反応には、Mg非常に多くの酵素が知られており、それぞれの酵素の特徴を示すサブタイプが定義されている。これは排他的な分類ではなく、たとえばIIA型でかつIIS型の酵素だとか、IIB型でかつIIH型の酵素などが存在する。まずは配列決定したいDNAを変性して一本鎖DNAを用意し、DNAポリメラーゼ(DNA polymerase)、アピラーゼ(Apyrase)、ATPスルフリラーゼ(Sulfurylase)、ルシフラーゼ(Luciferase)の4種類の酵素と、ルシフェリンとアデノシン5′-ホスホ硫酸の2種類の基質を加えます。このように、DNAの2本の鎖が分離することを変性（denaturation）という。DNAの変性は可逆的であり、条件を戻せば元の二重らせんに再生することができる。転写や複製のときにDNA鎖を開くのはDNAヘリカーゼという酵素だが、後述するように温度やpHを調整することで変性・再生をコントロールするこ … 二本鎖DNAは熱を加えるかNAOHによるアルカリ処理によって塩基対を形成する水素結合が切断され、一本鎖に解離することができます。また、ゆっくりと温度を戻すか中性条件にすれば互いに相補的な塩基対(A-T、G-C)どうしが会合して二本鎖DNAを再形成します。この過程のことをアニーリングといいます。一方で、異なる種類の核酸同士で相補的な塩基対を形成させて二本鎖にすることをハイブリダイゼーションといいます。アニーリングは塩基対形成の過程、ハイブリダイゼーションはその結果の意味 …

そうすることで、二本鎖のdnaが2つ出来上がることになるのです。 dnaポリメラーゼは酵素であるため、この高温で変性してしまうのでは？と考える方がおられるかもしれません。確かに通常の酵素であれば、72℃でも十分変性してしまいます。

制限酵素とは、特定の塩基配列を認識して二本鎖dnaを切断する酵素群であり、細菌の外来dnaに対する自己防御機構として発見されました。このDNAを切断する機能はDNAの塩基配列を操作する遺伝子組み換えには欠かせないツールとなっており、制限酵素は遺伝子組み換え実験等に頻繁に利用されています。 DNAは、２本のポリヌクレオチド鎖が塩基間の相補的な水素結合を介して結合したものである。共有結合による結合ではないため、２本の鎖はちょっとした操作で分離することができる。このように、DNAの２本の鎖が分離することを転写や複製のときにDNA鎖を開くのはDNAヘリカーゼという酵素だが、後述するように温度やpHを調整することで変性・再生をコントロールすることができる。これが、ハイブリダイゼーションやPCRの技術的基盤となっている。そもそも、DNAの二重らせん構造の安定性に影響する力には、以下のようなものがある。DNAは塩基の部分（塩基内の共役二重結合）で紫外線を吸収することが知られている。DNAの二重らせん構造は加熱することによって変性するが、DNA溶液の温度を徐々に上げていくと、熱に対する安定性がよくわかる。波長260 nmの紫外線への吸光度を測定すると、下図のような融解曲線になる。ある温度でDNAの一部が変性すると、残りの部分も変性し、吸光度は増大していく。このとき、DNAの二重らせん構造はpHによっても影響を受ける。ところがDNAの主鎖を構成する糖-リン酸骨格は、リン酸の部分が常にマイナスの電荷をもっている。隣接するリン酸基どうしは互いのマイナス電荷により反発するため、二重らせん構造は不安定化する。しかしDNAの変性剤として、尿素（NH上述のように、DNAの二重らせん構造は塩基間の水素結合と塩基対間の疎水性相互作用によっても安定化している。このような尿素やホルムアミドがDNA溶液中に存在するとどうなるだろうか。実は、

ModとResと呼ばれる2つのサブユニットから構成されており、Modが配列の認識とS-アデノシルメチオニンを用いたメチル化を行う。ResはDNA切断に必要なサブユニットだが、単独ではヌクレアーゼ活性を持っていない。認識配列は逆位反復になっている必要があり、その両方がメチル化されていない場合のみ片方から約25bp離れた位置をATP要求的に切断する。今日において制限酵素は、R・M・Sの3種のサブユニットから成っており、Rが切断活性、Mがメチル化活性、Sが配列特異性を担っている。特異的な認識部位でDNAに結合し、メチル化されていないDNAに対してはATP要求性のヌクレアーゼとして、片鎖がメチル化されているDNAに対してはS-アデノシルメチオニンを要求するメチラーゼとして働く。認識部位が特異的であるのに対し、二本鎖DNAの切断部位は認識部位から様々な距離（400～7000bp）で起こる。切断部位に再現性が乏しく、また特定の配列を認識して特定の位置で切断する酵素。通常はメチラーゼとは独立している。 DNA合成を行うDNAポリメラーゼにもいろいろあるが、下の表に生物がもつ主要なDNAポリメラーゼをリストアップした。この中でDNA複製に関与するのは、原核生物ではDNAポリメラーゼIとIII、真核生物ではDNAポリメラーゼα, δ, εである。DNAポリメラーゼの構造は、よく右手に例えられる。この右手を開いたり閉じたりしながら、DNAを合成していく。実は、DNAポリメラーゼはDNAを合成するだけではなく、上の表にもあるようにDNAを端から削るエキソヌクレアーゼ活性ももつ。とくに多くのポリメ …